WIWAM植物表型平臺：不同生長條件擬南芥葉片研究

WIWAM植物表型成像系統(tǒng)由比利時SMO公司與Ghent大學VIB研究所研制生產，整合了LED植物智能培養(yǎng)、自動 化控制系統(tǒng)、葉綠素熒光成像測量分析、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、植物多光譜分 析、植物CT斷層掃描分析、自動條碼識別管理、RGB真彩3D成像等多項*技術，以較優(yōu)化的方式實現(xiàn)大量植物樣 品——從擬南芥、玉米到各種其它植物的生理生態(tài)與形態(tài)結構成像分析，用于高通量植物表型成像分析測量、植 物脅迫響應成像分析測量、植物生長分析測量、生態(tài)毒理學研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

室內植物表型成像系統(tǒng)WIWAM Line

不同生長條件下擬南芥GRF3類轉錄因子促進葉片的顯著增長

作物產量的增加對于確保糧食安全以滿足不斷增長的全球需求至關重要。一些基因修飾可以增加器官的大小，從而提高作物產量。盡管如此，只有在少數情況下，在脅迫條件下對其性能進行了評估。MicroRNA miR396抑制生長調節(jié)因子（GRF）基因的表達，GRF基因編碼促進器官生長的轉錄因子。本文表面擬南芥At-GRF2和At-GRF3抗miR396活性基因（rGRF2和rGRF3）都增加了器官大小，但只有rGRF3可以產生這種效應而不會造成形態(tài)學缺陷。此外在甘藍中引入At-rGRF3可以增加器官的大小，而在擬南芥中引入大豆和水稻的At-rGRF3同源物也會增加葉片的大小。這表明miR396對GRF3活性的調節(jié)對于許多物種的器官生長是重要的。在干旱脅迫下，含有rGRF3的植物也有較大的葉片，這一條件刺激了miR396的積累。這些植物還表現(xiàn)出對毒力細菌的抗性增強，這表明rGRF3促進的大小增加在植物防御上沒有明顯的成本。我們的研究結果表明，rGRF3可以在正常和脅迫條件下增加植物器官的大小，是一種有價值的生物技術應用工具。

圖1.miRNA miR 396對GFR轉錄因子的廣泛控制

在擬南芥中有九個GRF（圖1a，b），其中七個GRF的miR396靶位位于編碼WRC結構域羧基端的區(qū)域（圖1b，c）。miRNA靶點在不同的GRF中是相同的，但位置8處除外，其中GRF 1-4中有一個C，GRF 7-8中有一個a，GRF9中有一個U（圖1c）。該可變堿基相對于miRNA位于凸起位置，因此對于所有轉錄因子而言，與miRNA的相互作用非常相似，然而，WRC結構域羧基端的編碼氨基酸序列不同（圖1c）。有趣的是，擬南芥GRF基因結構顯示外顯子-內含子組織和定義該家族的蛋白質結構域分布的差異（圖1b）。我們分析了不同被子植物GRF中miRNA靶點的出現(xiàn)情況（圖1d）。在許多物種中，如毛果楊、大豆和截形苜蓿，所有GRF都有一個miR396結合位點（圖1d），而在其他物種中，如擬南芥和水稻，一些基因缺少該序列。有趣的是，在擬南芥GRF5中有一個與miRNA靶點非常相似的序列，這是該物種中缺少miR396調控的兩個GRF之一（圖1c）。這些發(fā)現(xiàn)表明miR396廣泛分布GRF調節(jié)，并提示這可能是這些轉錄因子在被子植物中的默認狀態(tài)。

圖2.與rGRF2相比，rGRF3 在增加葉片尺寸方面的能力更強

分析了大約30株含有rGRF2 或 rGRF3的初級轉基因植物（圖2a，b），它們從它們自己的啟動子中表達出來。盡管兩種構建體都能夠增加葉面積，但由 rGRF3引起的效果顯著高于使用 rGRF2 獲得的效果。然后我們選擇了rGRF2和rGRF3 純合T3轉基因系并確定了GRF 轉錄水平（圖2d）。我們發(fā)現(xiàn)GRF3表達增加2倍足以改變70%的葉面積，而GRF2 轉錄本增加25倍以上需要引起器官大小的類似增加（圖 2d，e）. 在這兩種情況下，器官大小的增加是由于細胞數量的類似增加，細胞大小沒有明顯變化（圖2e、f 和 g）。

對rGRF2植物的進一步分析表明，葉片具有形態(tài)缺陷，包括長而扭曲的葉柄，葉片向下卷曲（圖2c）。另一方面，rGRF3植株除了葉面積增加外沒有觀察到明顯的形態(tài)變化。我們認為增加葉片尺寸所需的高水平GRF2也會導致植物發(fā)育中的額外形態(tài)缺陷。 為了確認啟動子不是rGRF2和rGRF3之間觀察到的差異的原因，我們從GRF3啟動子中表達了rGRF2 和 rGRF3，并觀察到pGRF3:rGRF3比pGRF3:rGRF2引起更大的葉面積增加（圖 2h）. 因此，表達水平和GRF蛋白序列都應被視為有效增強植物器官大小。如圖所示，雖然兩種rGRF均可用于增加器官大小，但rGRF3是植物器官大小的更活躍和特異性增強劑。

圖3.rGRF3樣基因增加異源物種的器官大小

本文分析了來自rice6和soybean8的GRF轉錄因子序列數據庫，并選擇了與At-GRF3最相似的數據庫。然后，我們在擬南芥At-GRF3啟動子下表達了大豆和水稻擬南芥GRF3樣編碼序列。由于這兩個基因都有一個miR396靶點，我們引入了同義突變以避免被小RNA識別。我們觀察到由大豆和水稻rGRF3樣轉錄因子引起的葉片大小增加（圖3a，b）。為了評估rGRF3對其他物種葉片大小的影響，我們在甘藍型油菜轉基因植物中表達了轉錄因子（圖3e）。對兩個獨立轉基因系的分析顯示，葉面積顯著增加20%和32%（圖3c，d）。對轉基因葉片的進一步表征表明，葉片大小的增加是由更多的細胞引起的，而不是由細胞大小的影響引起的（圖3c）。對甘藍rGRF3#10植物根系生長的評估表明，這些植物的初生根比對照植物的伸長率更高（圖3h，i）。此外，這些植物的種子大小也增加了10%（圖3f，g）。綜上所述，這些結果表明，當與miR396調控脫鉤時，來自不同物種的AtGRF3樣序列有力地增加了幾個器官的大小，包括葉、根和種子。

圖4.miR396-GRF系統(tǒng)對干旱脅迫的響應

干旱脅迫是一種相當復雜的情況，根據脅迫的大小和植物的發(fā)育階段會觸發(fā)不同的反應途徑。特別是，水限制條件抑制發(fā)育中器官的細胞增殖和擴張和/或在成熟器官中誘導一系列復雜的耐受和存活反應。在田間條件下，有限的水供應通常會降低植物生長、生物量積累，從而降低種子產量。使用自動表型分析平臺 WIWAM評估了植物對適度干旱脅迫的反應，包括土壤含水量減少。在這些條件下，用空載體轉化的對照植物的蓮座面積減少了40%（圖 4a），葉1面積減少了35%（圖4f）。

使用轉錄報告基因 MIR396B:GUS 觀察了 MIR396B 的表達，這使我們能夠監(jiān)測葉子中的 miR396 編碼基因的表達。播種后第 11 天 (DAS) 在澆水良好的盆中 MIR396B 在葉片 3 的近端以低水平表達，即仍處于增殖狀態(tài)（圖4b）。 MIR396B:GUS 的最高表達出現(xiàn)在葉的遠端區(qū)域，在該區(qū)域中細胞退出細胞周期。當植物受到輕度干旱脅迫時，葉片尺寸減小，并且在更大的遠端葉區(qū)域中檢測到 MIR396B:GUS 表達，并且染色更強烈（圖4b、c）。因此，小RNA 印跡顯示，受脅迫植物的發(fā)育葉片中成熟 miR396 水平增加了 70%（圖4d）。相比之下，At-GRF3 轉錄水平降低了約 60%（圖4e）?？傊?，這些結果表明 miR396 網絡響應干旱脅迫。然后我們評估了miR396-GRF3 調控nde在干旱脅迫期間的作用。為此我們首先分析了35S:miR396 植物對輕度干旱脅迫的反應，由于miRNA 的過度表達和 GRFs12 的抑制，這些植物的葉子很?。▓D4f）。當對這些植物施加干旱脅迫時，未觀察到器官大小的進一步減?。▓D4f），表明轉基因 miR396 過表達掩蓋了源自內源性誘導的MIR396B的影響。

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